Исследование посвящено изучению возможности применения спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации растительного сырья на примере золотарника канадского и борщевика Сосновского. Анализ полученных результатов показал, что высокая информативность спектров ядерного магнитного резонанса 13С водно-спиртовых экстрактов позволяет использовать наборы химических сдвигов для паспортной идентификации лекарственных форм на основе упомянутого растительного сырья.
ядерный магнитный резонанс, растительное сырье, золотарник канадский, борщевик Сосновско-го, паспортная идентификация
Введение. В арсенале современных лекарственных средств препараты, получаемые из растительного сырья, представляют собой группу особо ценных фармакологических объектов. Несмотря на безусловные достижения биоорганической химии, потребность практического здравоохранения, фармацевтической промышленности в производстве лекарств из растительного сырья растет особенно быстро по многим причинам. Во-первых, как естественная составная часть парадигмы лекарственного воздействия, во-вторых, в силу обоснованного смещения акцента от синтетических препаратов (важность которых никто не подвергает сомнению) в сторону средств природного происхождения, в-третьих, этого требует устойчивый вектор импортозамещения на территории нашего лекарственного рынка и т.д. Есть еще одно важное обстоятельство: комплекс веществ, содержащихся в растении, часто действует несколько иначе, чем выделенное из него индивидуальное химически чистое вещество. Несомненно, что лечебное действие растительных препаратов реализуется именно за счет комплекса биологически активных веществ, усиливающих, ослабляющих или даже видоизменяющих действие главных акторов. Вслед за возрастающим интересом к лекарственным средствам на растительной основе естественным образом повышаются требования к их стандартизации – идентификации, определению количества биологически активных веществ в фитопрепарате, к методам контроля качества.
Как известно, сложность работы с лекарственными растениями состоит в невозможности индивидуальной идентификации сырья в связи с затрудненностью количественной оценки каждого его компонента как из-за бесконечно разнообразного спектра химических структур, так и понятного отсутствия стандартных образцов. Оценка качества и подлинности сырья по единичным компонентам имеет еще и тот недостаток, что при этом из поля зрения исчезает шлейф соединений, сопутствующих основным объектам внимания, но, как правило, драматически влияющих на их эффективность [1].
В таком контексте оправдано внимание к двум дикорастущим растениям, широко распространенным по территории России: золотарнику канадскому (ЗК, Solidago Canadensis) и борщевику Сосновского (БС, Heracléum Sosnówskyi). Различные виды золотарника, в том числе и ЗК, являются официнальными растениями, они входят в Европейскую, Британскую и Бразильскую фармакопеи [2, 3, 4], имеются зарегистрированные препараты на основе ЗК (Простанорм, Урофлукс, Марелин, Цистиум солидаго, Фитолизин) [5].
БС с давних пор использовала народная медицина в виде лекарственных отваров и настоек [6], но в официнальную медицину это растение пока не вошло. Показано, что доминантные биологически активные вещества в составе БС по химической структуре относятся к разнообразным кумаринам и фурокумаринам (Фуранокумарины (фурокумарины) – класс кислородсодержащих гетероциклических соединений в которых фурановый цикл конденсирован с бензольным циклом кумаринового ядра линейно (производные псоралена) или ангулярно (производные ангелицина и аллопсоралена)) (ксантотоксин, бергаптен, ангелицин, сфондин) [7, 8]. Для них установлено фотосенсибилизирующие действие, они стимулируют рост волос, восстанавливают пигментацию кожи и волос, их биологическая активность используется для лечения витилиго, гнездной плешивости, псориаза, микозов. Присутствием в БС оксикумаринов объясняют антикоагулянтный, Р-витаминный, капилляроукрепляющий и тонизирующий эффекты. В принципе сырье на основе БС сможет также использоваться для производства препаратов, направленных на профилактику и лечение тромбофлебитов, тромбозов, геморроя, тромбоэмболии. Безусловным плюсом для возможной заготовки является то, что БС – крайне неприхотливое растение, устойчивое к погодным условиям и по своей способности к саморазмножению отнесено к категории сорных и даже агрессивных [9]. Несмотря на то, что работа с БС требует соблюдения вполне определенных мер предосторожности, богатый и разнообразный химический состав этого растения позволяет утверждать, что перспектива практического применения в лечебной практике лекарственных средств на основе этого вида растительного сырья вполне вероятна [10]. Несмотря на то, что на сегодняшний день в РФ отсутствует нормативная документация на сырье борщевика, имеются исследования [11], предваряющие использование сырья на основе БС в фармацевтической промышленности и разработку стандартов, определяющих его качество.
В числе приоритетных направлений развития аналитической химии обозначен «безэталонный метод оценки качества» или «фингерпринт» – метод распознавания общего спектроскопического образа объекта, успешно используемый в ряде стран для идентификации растительного сырья и препаратов на его основе. Любое растительное сырье, независимо от его происхождения, содержит обширный спектр веществ, относящихся к совершенно различным как по структуре, так и по составу, классам соединений, полная дифференциация которых представляет собой, как правило, исключительно трудную задачу. Но поскольку в этом нет необходимости при рутинной идентификации сырья и оценке его качества, обзорные спектры в таких случаях, являясь вполне индивидуальными, могут являться основанием для экспертного заключения о пригодности растительного объекта для дальнейшего использования в медицинской практике.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) давно зарекомендовала себя в качестве надежного аналитического инструмента, по всем критериям отвечающего современным требованиям фармацевтической науки [12, 13, 14]. Подтверждением этого является то обстоятельство, что действующая Фармакопея допускает [15] использование одномерных спектров ЯМР целиком, как «отпечатков пальца» объекта, без детализации значений химических сдвигов δ и мультиплетности отдельных сигналов.
1Н ЯМР-спектры объектов органического происхождения, как правило, представляют собой довольно сложную картину, поскольку включают в себя сигналы протонов множества разнородных соединений. Поэтому для исследования природных объектов широко используется ЯМР
13C-спектроскопия, поскольку она позволяет получать непосредственную информацию об углеродной структуре органических молекул, которые обычно являются носителями биологической активности. Имеются и другие преимущества спектроскопия 13C ЯМР, подробно описанные в специальной литературе [16, 17].
Цель: разработать подходы к спектроскопическому профилированию экстрактов золотарника канадского и борщевика Сосновского методом ЯМР 13С с целью использования в дальнейшем полученной информации для идентификации сырья, оценки его качества, а также для уточнения номенклатуры органических веществ, входящих в состав данных лекарственных растений.
Материалы и методы исследования. Материалами для исследования послужили трава ЗК и листья БС собранные в Московской области в 2020 году и идентифицированные кафедрой фармацевтического естествознания Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Сырье подвергалось естественной сушке с хорошей вентиляцией до воздушно-сухого состояния. Показатель «Потеря в массе при высушивании» был получен по методике, отраженной в ОФС 1.2.1.0010.15. Для анализа были приготовлены водные и водно-спиртовые извлечения сырья по методикам, рекомендованным Государственной фармакопеей РФ XIV издания.
Нами осуществлена запись спектров высокого разрешения магнитного резонанса ядер изотопа углерода-13 образцов водных и водно-спиртовых (70%) извлечений изучаемого сырья. Спектры ЯМР 13С[1H] высокого разрешения с широкополосным подавлением протонов (1Н) записаны при комнатной температуре (298К) по стандартной одноимпульсной программе [16] на спектрометре AVANCE-300 (Bruker, Германия) со сверхпроводящим магнитом.
Накопление сигналов ЯМР 13С осуществлялось в режиме широкополосного протонного (1Н) облучения, в результате чего в спектрах С-13 растворов экстрактов не проявляются мультиплеты из-за скалярных спин-спиновых 13С-1Н взаимодействий, что существенно упрощает спектры С-13 для идентификации сигналов. Однородность магнитного поля настраивалась по сигналу дейтерия образца тяжелой воды D2O, как внешнего стандарта. Все химические сдвиги С-13 образцов экстрактов приведены относительно сигнала тетраметилсилана Si(CH3)4 в миллионных долях (м.д. или ppm) [16, 17].
Результаты исследования и их обсуждение. На рис. 1 и 2 приведены спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов для водного и водно-спиртового экстрактов БС соответственно. Спектры С-13 представляют собой наборы сигналов, состоящие из 30-40 линий с индивидуальными пиковыми интенсивностями и химическими сдвигами. Значения химических сдвигов (ppm) сигналов С-13 приведены в верхней части спектров. Набор сигналов в спектрах ЯМР 13С[1H] экстрактов характеризует индивидуальность извлеченного семейства органических молекул в зависимости от типа растворителя. Сравнительный анализ спектров ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов водного и водно-спиртового экстрактов БС, приведенных на рис. 3, показывает, что лишь небольшая часть сигналов в этих спектрах совпадает по значениям химических сдвигов. Тогда как основная часть сигналов в спектрах имеет свои индивидуальные значения химических сдвигов и пиковых интенсивностей в зависимости от использованного экстрагента. Иначе говоря, основная часть состава химических молекул водного раствора экстракта БС существенно отличается от состава химических молекул водно-спиртового экстракта БС.
Рис. 1. Обзорный спектр ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов
водного экстракта БС
Fig. 1. Panoramic 13C NMR spectrum with broadband proton suppression of an aqueous extract of BS
Рис. 2. Обзорный спектр ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов
водно-спиртового экстракта БС
Fig. 2. Panoramic 13C NMR spectrum with broadband proton suppression of a hydroalcoholic extract of BS
Водный и водно-спиртовый экстракты БС содержат в своем составе целый спектр разнообразных представителей кумаринов и фурокумаринов, о чем свидетельствует отнесение химических сдвигов сигналов спектров ЯМР [16, 17] и что, в свою очередь, адекватно данным литературы [6, 7, 8, 9, 10, 18] и соответствующим компьютерным программам [19].
Рис. 3. Обзорные спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов
водного экстракта БС (нижний спектр) и водно-спиртового (70 %) экстракта БС (верхний спектр)
Fig. 3. Panoramic 13C NMR spectra with broadband proton suppression of an aqueous extract of BS (lower spectrum) and a hydroalcoholic (70 %) extract of BS (upper spectrum)
На рис. 4 приведены обзорные спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов водного и водно-спиртового экстрактов золотарника. Спектр водно-спиртового экстракта (около 60 сигналов) существенно отличается от спектра водного экстракта (порядка 45 сигналов), при этом сигналы в спектрах, как правило, не совпадают по значениям химических сдвигов, т.е. проанализированные экстракты различны по своему составу. Более детально различия видны при сопоставлении фрагментов растянутых спектров, которые представлены на рис. 5.
Принимая во внимание, что использованные нами экстрагенты обладают неодинаковой полярностью, они по-разному извлекают вещества из растительного сырья. Вода, являясь неорганическим растворителем, не способна растворить в достаточной степени органические вещества липофильного характера,но в то же время извлекает балластные вещества и проявляет нежелательную гидролитическую активность. Таким образом, для получения оптимальных комплексов биологически активных веществ из растительного сырья на основе золотарника канадского и борщевика Сосновского в качестве экстрагента следует использовать водно-спиртовую смесь.
Рис. 4. Обзорные спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов - 1)
водный экстракт ЗК (нижний спектр), 2) водно-спиртовый экстракт ЗК (верхний спектр).
Fig. 4. Survey 13C NMR spectra with broadband proton suppression - 1) aqueous extract of SC (lower spectrum), 2) hydroalcoholic extract of SC (upper spectrum)
Химические сдвиги сигналов спектров ЯМР водного и водно-спиртового экстрактов золотарника, соотнесенные с фундаментальными данными [16, 17], соответствуют литературным данным
[20-22] о присутствии полифенолов, карбоновых кислот, сапонинов тритерпенового ряда, разнообразных ароматических структур.
Таким образом, очевидная более высокая информативность спектров ЯМР 13С водно-спиртовых экстрактов позволяет рекомендовать использовать для паспортной идентификации сырья и лекарственных форм на основе ЗК и БС набор химических сдвигов С-13.
В то же время разнообразие уже известных видов биологической активности золотарника и борщевика все еще не соответствует имеющейся информации об их химическом составе. В этой связи на следующем этапе нашей работы мы предполагаем изучить спектры ЯМР экстрактов ЗК и БС на ядрах изотопа 31Р.
|
А
|
|
|
|
|
Б
|
|
|
|
|
|
Рис. 5. Растянутые спектры ЯМР 13С с широкополосным подавлением протонов экстрактов ЗК: А – водный,
Б – водно-спиртовый. Отнесение диапазонов I, II и III в тексте
Fig. 5. Stretched 13С NMR spectra with broadband proton suppression of SC extracts: A – water,
B – hydroalcoholic. Assignment of ranges I, II and III in the text
Заключение. Экспериментально подтверждено, что спектры ЯМР 13С водно-спиртовых экстрактов золотарника канадского и борщевика Сосновского обладают высокой информативностью, что позволяет использовать набор химических сдвигов С-13 для паспортной идентификации сырья и лекарственных форм на его основе.
1. Павлова Л. В. Экстракционно-хроматографическое определение физиологически-активных компонентов цветов «ромашки аптечной» и листьев «эвкалипта прутовидного»: дис. … канд. хим. наук. Самара, 2015. 176 с.
2. European Pharmacopoeia 6.0. Nordlingen. 2007-2011.
3. British Pharmacopoeia. London, 2009. Vol. 1.
4. Liz R., Vigil S. V. G., Goulart S., Moritz M. I. The anti-inflammatory modulatory role of Solidago chinensis Meyen in the murine model of the air pouch // Pharm. Pharmacol. 2008. Vol. 60, no 4. P. 515-542.
5. Сулейманова Ф. Ш., Нестерова О. В., Матюшин А. А. Исторический опыт и перспективы использования травы золотарника канадского (Solidago сanadensis L. в медицине) // Здоровье и образование в XXI веке. 2017. Т.19, № 4. С. 142-149.
6. Черняк Д. М. Биологическая активность борщевика // Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 70-72.
7. Юрлова Л. Ю., Черняк Д. М., Кутовая О. П. Фурокумарины Heracleum sosnowskyi и Heracleum moellendorffii // Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 91-93.
8. Георгиевский В. П., Комиссаренко Н. Ф., Дмитрук С. Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. «Наука» - Новосибирск. 1990. 336 с.
9. Антипина Г. С., Маганов И. А., Платонова Е. А., Фалин А. Ю. Борщевик Сосновского (Heracleum sosnowskyi Manden.) в Ботаническом саду ПетрГУ // Hortus botanicus. 2017. № 12. С. 345-351.
10. Ткаченко К. Г. Борщевики (род Heracleum L): pro et contra // Биосфера. 2015. Т. 7, № 2. С. 209-216.
11. Иванова Т. А, Матвеева Т. Н., Чантурия В. А., Иванова Е. Н. Особенности состава многокомпонент-ных экстрактов борщевика и его влияние на флотационные свойства золотосодержащих сульфидов // Обога-щение полезных ископаемых. 2015. № 4. С. 151-157.
12. Васильев В. Г. Контроль качества лекарственных средств и объектов растительного происхождения методом спектроскопии ЯМР 1Н без использования стандартных образцов: дис. … канд. хим. наук. Москва, 2018. 177 с.
13. Нестерова О. В., Сулейманова Ф. Ш., Прокопов А. А., Привалов В. И. Предварительное изучение экс-трактов золотарника методом 13С ЯМР-спектроскопии // Фармацевтический анализ и контроль качества лекарственных средств. 2018. Т. 22, № 4. С. 9-13.
14. Моисеев С.В., Крылов В.И., Кузьмина Н.Е., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Использование метода ЯМР-спектроскопии в фармакопейном анализе / Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2016. № 2, С. 53-57.
15. Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания. ОФС.1.2.1.1.0007.15. «Спектроскопия ядерного магнитного резонанса». Том 1. М.: 2018. С. 784-795.
16. Воловенко Ю.М., Карцев В.Г., Комаров И.В., Туров А.В., Хиля В.П. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для химиков. МБФНП (ICSPF), М., 2011. 704 с.
17. Сильверстейн Р., Вебстер Ф., Кимл Д. Спектрометрическая идентификация органических соединений». БИНОМ. Лаборатория знаний, М., 2012. 557 с.
18. Luz Raphael F., Vieira Ivo J. C., Braz-Filho Raimundo, Moreira Vinicius F. 13C-NMR Data from Coumarins from Moraceae Family // American Journal of Analytical Chemistry. 2015. no. 6. Р. 851-866.
19. ACD/CNMR DB (v.6.12).
20. Федотова В. В., Челомбитько В. А. Виды рода золотарник (Solidago): значение для медицинской практики, перспективы изучения // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. 2012. Т. 135, № 16, вып. 19. С. 136-145.
21. Apati P., Szentmihalyi K., Kristo Sz. T., Papp I., Vinkler P., Szoke E., Kery A. Herbal remedies of Solidago - correlation of phytochemical characteristics and antioxidative properties // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analisis. 2003. Vol. 32, no 4-5. P. 1045-1053.
22. Apati P., Szentmihalyi K., Balazc A., Baumann D., Hamburger M., Kristo T. Sz., Szoke E., Kery A. HPLC Ananlysis of the flavonoids in pharmaceurical preparationsfrom Canadian goldenrod (Solidago canadensis) // Chro-matographia Supplement. 2002. Vol. 56. P. 65-68.
